孕酮单克隆抗体的制备与应用

一、孕酮单克隆抗体的基本概念

性质：孕酮（Progesterone）是甾体类激素，分子量约 314 Da，属于半抗原（无免疫原性），需与载体蛋白（如 BSA、OVA）偶联后才能诱导动物产生特异性抗体。

制备目的：用于孕酮的定量检测（如 ELISA、化学发光）、免疫组化、免疫亲和纯化等，在生殖医学、兽医学、药物研发中具有重要价值。

二、孕酮单克隆抗体的制备流程

1. 半抗原 - 载体蛋白偶联（关键前提）

孕酮半抗原设计：

孕酮分子无免疫原性，需在 C3 或 C11 位引入羧基侧链（如 11α- 羟基孕酮 - 3 - 羧甲基肟，11α-OH-P4-CMO），通过羧基与载体蛋白的氨基（-NH₂）偶联。

偶联方法（以 BSA 为例）：

碳二亚胺法（EDC 法）：

称取孕酮半抗原（10 mg）溶于 DMF，加入 EDC（15 mg）和 NHS（10 mg），室温活化 30 分钟。

将活化后的半抗原逐滴加入 BSA 溶液（10 mg/mL，PBS pH 7.4），4℃搅拌偶联过夜。

用 PD-10 柱或透析法（0.01 M PBS，4℃，24 小时）去除未偶联小分子，紫外分光光度法测定偶联比（理想偶联比：半抗原：BSA=10-20:1）。

2. 动物免疫与脾细胞制备

免疫动物选择：

6-8 周龄 Balb/c 小鼠，雌性（免疫反应更稳定），每组 5-8 只。

免疫方案：

初次免疫：将孕酮 - BSA 偶联物（200 μg/mL）与等体积弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射小鼠（每只 100 μL）。

加强免疫：2 周后，用孕酮 - BSA（100 μg/mL）与弗氏不完全佐剂乳化，腹腔注射（每只 100 μL），共 3-4 次，每次间隔 2 周。

末次免疫：融合前 3 天，尾静脉注射孕酮 - BSA（50 μg / 只，不加佐剂），增强脾细胞抗体分泌能力。

脾细胞获取：

末次免疫后第 3 天，无菌取小鼠脾脏，研磨过 200 目筛网，制备单细胞悬液，离心（1500 rpm，5 分钟）弃上清，PBS 洗涤 2 次。

3. 细胞融合与杂交瘤细胞筛选

骨髓瘤细胞准备：

选用对数生长期的 SP2/0 或 NS0 骨髓瘤细胞，用完全培养基（RPMI 1640 + 10% FBS + 1% 双抗）培养，融合前 24 小时换液。

融合过程：

脾细胞与骨髓瘤细胞按 5:1-10:1 比例混合，离心（1200 rpm，5 分钟）弃上清，轻弹管底使细胞沉淀松散。

37℃水浴中，缓慢加入 50% PEG 1500（预热至 37℃），1 分钟内加完，静置 90 秒，再缓慢加入预热的不完全培养基（1640）终止融合（2 分钟内加 5 mL，5 分钟内加 10 mL）。

离心（1200 rpm，10 分钟）弃上清，用 HAT 选择性培养基（含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）重悬细胞，接种至 96 孔板（每孔 200 μL，约 2×10⁵细胞 / 孔）。

筛选与克隆化

HAT 筛选：培养 4-5 天后，未融合的脾细胞（不能长期存活）和骨髓瘤细胞（被氨基蝶呤抑制）死亡，仅杂交瘤细胞存活。

间接 ELISA 筛选阳性克隆：

有限稀释法克隆化：
将阳性孔细胞稀释至 0.5-1 cell / 孔，接种至 96 孔板，用 HT 培养基（不含氨基蝶呤）培养，待克隆生长至孔底 1/3 面积时，用 ELISA 再次筛选，重复克隆 2-3 次，直至单克隆抗体阳性率 100%。

包被：孕酮 - OVA 偶联物（1 μg/mL）包被 96 孔板，4℃过夜，PBST 洗涤 3 次。

封闭：1% BSA-PBS 37℃封闭 1 小时，洗涤。

加样：取培养孔上清（1:10 稀释），37℃孵育 1 小时，洗涤后加 HRP 标记的羊抗鼠 IgG（1:5000），37℃孵育 30 分钟，洗涤。

显色：加入 TMB 底物，20 分钟后加 2 M H₂SO₄终止，测 OD₄₅₀值，选择 OD 值高、阴性对照 OD 值低的孔（P/N≥2.1）。

4. 单克隆抗体的生产与纯化

腹水制备（常用方法）：

小鼠腹腔注射液体石蜡（0.5 mL / 只），7 天后注射杂交瘤细胞（1×10⁶ cells / 只）。

7-10 天后收集腹水，4℃离心（3000 rpm，10 分钟），取上清，-20℃保存。

细胞培养上清生产：
用无血清培养基（如 SFM4CHO）扩大培养杂交瘤细胞，收集培养上清（抗体浓度较低，适用于实验室小量制备）。

抗体纯化：

Protein A/G 亲和层析：腹水或上清经 0.22 μm 滤膜过滤，上样至 Protein A/G 柱，用 0.1 M 甘氨酸 - HCl（pH 2.5）洗脱，立即用 1 M Tris-HCl（pH 8.0）中和，PBS 透析脱盐，BCA 法测定蛋白浓度。

辛酸 - 硫酸铵沉淀法（低成本方案）：

腹水用 0.1 M 醋酸缓冲液（pH 4.5）调 pH 至 4.5，4℃搅拌下逐滴加入辛酸（终浓度 25 μL/mL），静置 30 分钟，离心（10000×g，20 分钟）取上清。

上清用 1 M NaOH 调 pH 至 7.0，缓慢加入硫酸铵（终饱和度 45%），4℃静置 2 小时，离心（10000×g，20 分钟）收集沉淀，PBS 溶解后透析脱盐。

5. 抗体鉴定

效价测定：

间接 ELISA：将抗体倍比稀释（1:1000 至 1:10⁶），检测能与孕酮 - OVA 结合的最高稀释倍数（效价），腹水抗体效价通常≥1×10⁶。

特异性分析：

交叉反应率（CRR）：用结构类似物（如睾酮、皮质醇、雌二醇等）进行竞争 ELISA，计算 IC₅₀值，CRR=（孕酮 IC₅₀/ 类似物 IC₅₀）×100%，理想孕酮抗体对睾酮等激素的 CRR＜1%。

竞争抑制曲线：用不同浓度孕酮（0.1-100 ng/mL）进行竞争 ELISA，绘制抑制曲线，评估抗体亲和力（IC₅₀越低，亲和力越高，理想 IC₅₀＜1 ng/mL）。

亚型鉴定：
用小鼠 IgG 亚型检测试剂盒（如 ELISA 法）确定抗体亚型（常见为 IgG1 或 IgG2a）。

三、孕酮单克隆抗体的应用场景

医学诊断：

制备 ELISA 或化学发光试剂盒，检测血清、尿液中孕酮水平，用于早期妊娠诊断、黄体功能评估、辅助生殖技术（IVF）中排卵监测。

兽医学与畜牧业：

检测动物（如牛、羊）孕酮水平，辅助发情周期管理、妊娠诊断，提高繁殖效率。

药物研发：

作为标准品或检测工具，用于孕酮类药物（如避孕药、安胎药）的药代动力学研究或质量控制。

基础研究：

免疫组化检测组织中孕酮受体分布，或用于免疫沉淀（IP）研究孕酮相关蛋白互作。

四、关键技术难点与注意事项

半抗原设计与偶联效率：
半抗原侧链位置影响抗体特异性（如 C3 位偶联可能更易暴露孕酮抗原表位），偶联比需严格控制，过低影响免疫原性，过高可能导致空间位阻。

抗体特异性优化：
筛选时需用高浓度类似物（如睾酮）进行负筛选，去除交叉反应性克隆，或在免疫过程中加入类似物作为竞争抗原，提高特异性。

稳定性与保存：
抗体溶液需加入 0.05% 叠dan化钠防腐，分装后 - 20℃或 - 80℃保存，避免反复冻融；长期保存建议添加 50% 甘油。

规模化生产：
腹水法成本低但可能含内毒素，适用于科研；工业级生产可采用杂交瘤细胞发酵罐培养或转基因动物（如小鼠乳腺表达系统），提高抗体产量和纯度。