抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）抗体制备、特性、应用及研究进展

一、抗 PEDV 抗体的制备

1. 抗原选择

• 病毒结构蛋白抗原：
  • 刺突蛋白（S 蛋白）：PEDV 的主要免疫原性蛋白，介导病毒与宿主细胞受体的结合及膜融合，是中和抗体的主要靶点。S 蛋白可分为 S1（负责受体结合）和 S2（负责膜融合）亚基，其中 S1 亚基的 N 端结构域（NTD）和 C 端结构域（CTD）是中和表位的主要区域。
  • 核衣壳蛋白（N 蛋白）：保守性高，免疫原性强，常用于病毒的通用检测（如 ELISA、胶体金试纸条）。
• 抗原制备方式：
  • 重组抗原：通过大肠杆菌、酵母或昆虫细胞表达 S 蛋白胞外区（如 S1 亚基）或 N 蛋白，纯化后作为免疫原，安全性高且抗原性稳定。
  • 灭活病毒：使用甲醛或 β- 丙内酯灭活的 PEDV 全病毒，免疫原性完整，但需在生物安全二级（BSL-2）实验室操作。

2. 制备流程（以单克隆抗体为例）

1. 动物免疫：选用 SPF 级 Balb/c 小鼠或兔子，以重组 S1 蛋白或灭活病毒免疫 3 - 5 次，间隔 2 - 4 周，末次免疫后 3 天取脾细胞（小鼠）或淋巴结细胞（兔子）。
2. 细胞融合与筛选：脾细胞与骨髓瘤细胞（如 SP2/0）融合后，通过有限稀释法克隆杂交瘤细胞，利用间接 ELISA、病毒中和试验（VNT）或免疫荧光（IFA）筛选特异性抗体分泌株。
3. 抗体生产与纯化：腹水法（小鼠 MAb）或细胞培养上清（适用于兔多抗或小鼠 MAb）制备抗体，经 Protein A/G 亲和层析或硫酸铵沉淀法纯化，纯度可达 95% 以上。

二、抗 PEDV 抗体的特性

1. 类型与特异性

• 单克隆抗体（MAb）：
  • 亚型：常见为 IgG1、IgG2a（小鼠），兔源多抗以 IgG 为主。
  • 特异性：
    • 中和性 MAb：靶向 S 蛋白的中和表位（如 S1 亚基的 NTD 或 CTD），可阻断病毒与宿主细胞 ACE2 受体的结合，如 MAb 4C7 对 PEDV 经典株（如 CV777）的中和效价（IC₅₀）可达 0.1 μg/mL。
    • 非中和性 MAb：靶向 N 蛋白或 S 蛋白非中和区域，用于病毒抗原检测（如胶体金试纸条中的捕获抗体）。
• 多克隆抗体（PAb）：由灭活病毒或全蛋白免疫动物制备，可识别多个抗原表位，检测灵敏度高，但特异性略低于 MAb，常用于 ELISA 或 Western blot。

2. 生物学功能

• 中和病毒感染：中和抗体（尤其是抗 S 蛋白抗体）可通过阻止病毒吸附、融合或内化，降低病毒感染力。例如，抗 S1 的 MAb 可使 PEDV 对 Vero 细胞的感染率降低 90% 以上。
• 抗原检测与病毒分型：抗 N 蛋白的抗体可识别各 PEDV 毒株（包括经典株和变异株），而抗 S 蛋白的抗体可能因毒株抗原变异（如 S1 亚基的氨基酸突变）出现交叉反应差异，可用于病毒分型。
• 免疫调理与 ADCC 作用：多克隆抗体或某些 MAb 可通过 Fc 段与免疫细胞（如巨噬细胞）结合，增强对病毒的吞噬或杀伤作用。

三、抗 PEDV 抗体的应用场景

1. 病毒检测与流行病学调查

• 胶体金试纸条：
  • 结构：T 线包被抗 N 蛋白多抗或 MAb，金标垫偶联抗 N 蛋白抗体（另一表位），样本中的 PEDV 抗原与金标抗体结合后，被 T 线抗体捕获，形成 “金标抗体 - 抗原 - T 线抗体” 复合物，检测限（LOD）可达 5 ng/mL（病毒抗原）。
  • 优势：10 - 15 分钟内出结果，适用于猪场现场快速筛查粪便、肠内容物或组织匀浆中的 PEDV。
• ELISA 试剂盒：
  • 双抗体夹心 ELISA：包被抗 N 蛋白抗体，酶标抗 N 蛋白另一表位抗体，定量检测 PEDV 抗原，线性范围为 1 - 100 ng/mL，批内变异系数 < 8%。
  • 间接 ELISA：包被重组 S1 蛋白，检测猪血清中的特异性 IgG 抗体，用于评估疫苗免疫效果或感染状态，临界值（cut-off）设定为 OD450nm≥0.2（阴性对照均值 + 3SD）。
• 病毒中和试验（VNT）：利用中和抗体（如抗 S 蛋白 MAb）与 PEDV 孵育后，接种 Vero 细胞，通过 CPE（细胞病变效应）或荧光定量 PCR 检测病毒感染率，评估抗体中和效价，是判断疫苗保护力的金标准。

2. 疫苗研发与效果评价

• 中和抗体效价测定：疫苗免疫猪血清中的中和抗体滴度（如 VNT 50% 中和效价）与保护力正相关，例如，灭活疫苗诱导的中和抗体滴度≥1:32 时，可对 PEDV 攻毒提供部分保护。
• 表位映射与疫苗设计：通过中和 MAb 筛选 S 蛋白的关键中和表位，可指导亚单位疫苗（如 S1 蛋白疫苗）或病毒样颗粒（VLP）疫苗的优化，例如，针对变异株 S1 亚基的高变区设计疫苗，可提高对流行毒株的保护率。

3. 致病机制与治疗研究

• 病毒 - 宿主互作研究：抗 S 蛋白 MAb 可用于免疫沉淀（IP）或免疫荧光共定位，探究 PEDV 与宿主细胞受体（如 ACE2、氨肽酶 N）的结合机制。
• 被动免疫治疗：高滴度中和抗体（如猪康复血清或特异性 MAb）可通过腹腔或口服给药，用于新生仔猪的紧急预防或治疗。例如，仔猪口服 10 mL 含高中和抗体的血清（中和滴度≥1:1000），可使腹泻发生率降低 60% - 80%。

四、代表性抗体实例

五、研究进展与挑战

1. 最新进展

• 纳米抗体（VHH）开发：从骆驼或羊驼免疫库中筛选抗 PEDV S 蛋白的 VHH，其分子量小（约 15 kDa）、稳定性高，可口服给药用于仔猪保护。例如，VHH-12 对 PEDV 变异株的中和效价（IC₅₀）达 0.05 μg/mL，且在胃酸环境中活性保留率 > 80%。
• 双功能抗体：构建同时识别 PEDV S 蛋白和宿主细胞因子（如 IL-10）的双特异性抗体，既可中和病毒，又能抑制肠道炎症，动物试验显示可降低仔猪腹泻持续时间 50% 以上。

2. 面临挑战

• 病毒变异与抗原漂移：近年来 PEDV 变异株（如 GII.4 型）的 S1 亚基出现多处突变，导致传统中和抗体（如针对经典株的 MAb）中和效价下降，需持续筛选针对流行株的广谱中和抗体。
• 生产工艺优化：重组抗体（如人源化 MAb）的大肠杆菌表达系统可能存在糖基化缺陷，影响抗体活性；而哺乳动物细胞表达成本高，需开发高效低成本的生产平台（如植物细胞表达系统）。